protein protein(protein的作用)-东辰安华生活网

protein protein(protein的作用),本文通过数据整理汇集了protein protein(protein的作用)相关信息，下面一起看看。

近年来RNA开始流行，如小鲜肉F4: mirna、lncRNA、circRNA和piRNA，它们直接或间接地调节mRNA的翻译和基因的转录。这些研究热点也成了做论文做实验的最爱，不管核心还是SCI，不管是CNS还是低级SCI，不管是灌水还是酝酿大招。没有非编码RNA的研究机制，我都不好意思在里面投稿。感觉没有miRNA的帮助故事讲不下去，能编码蛋白质做正经工作的mRNA被冷落了。大家开始喜欢上遍布细胞的监督者：非编码RNA(ncRNA)。

诚然，ncRNA近年来成为十大杰出人才，颜值高，会做事，受大家喜爱。但归根结底还得和表现型挂钩，最后还得通过蛋白质实现表观遗传能力。所以，蛋白质要想做大文章，登峰造极，除了抱ncRNA的大腿，分析技巧是不能丢的。不，X湿哥这几天在学新东西：蛋白质的常规检测技术。

那么，我们对蛋白质的哪些特性感兴趣呢？

(1)蛋白质的分子量，是否有亚基？

(2)蛋白质的序列

(3)蛋白质的功能预测

(4)细胞内的蛋白质在哪里工作？胞外蛋白呢？

(5)蛋白质磷酸化检测

(6)蛋白质相互作用

(7)蛋白质与DNA和RNA相互作用。

(a)蛋白质的分子量，亚单位的存在与否

技术：蛋白质层析，SDS-PAGE，Native-PAGE

当你发现一种闻所未闻的蛋白质，想知道它的分子量，有没有亚基，可以做以下实验，比如血红蛋白是四聚体。

1)天然蛋白质的分离：蛋白质色谱法(这是罕见的)

也称为分子筛色谱法，是根据分子大小分离蛋白质混合物的最有效方法之一。色谱柱中最常用的填料是Sephadex ged。可以自行搜索以下品牌PharmaciaTM。在蛋白质色谱中，是市场份额最大的超人存在(小张说是广告，应该删掉，但真的不是广告)。

2)重组蛋白的分离：6*HIS标签、GST蛋白标签等。

当年X哥湿纯化重组蛋白多少次？多苦的眼泪啊！

大家都钓过吧？重组蛋白就是利用了这个原理。

1.Pond:大肠杆菌或哺乳动物细胞诱导表达后的混合物，目的蛋白在其中。

2.诱饵：能特异性吸附蛋白质头部或尾部的蛋白质标签(比如他的组氨酸标签被镍离子吸附)。

3.钓鱼竿：色谱柱中的凝胶填料和固体载体。

(请关注下一篇微信文章：重组蛋白纯化技术)

3)SDS-PAGE:变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

和SDS巯基乙醇一样，蛋白质的高级结构被完全瓦解和严重破坏。在电场的作用下，变成直杆的蛋白质会在PAGE的网格中向前穿梭。头越小，跑得越快。头越大，阻力越大，跑得越慢。然后这个组织或者细胞的蛋白质就会在PAGE的跑道上依次排队，通过已知的分子量就可以分析出你的蛋白质。

4)Native-PAGE:不含SDS和巯基乙醇，蛋白质依然纯净如冰。

非变性凝胶电泳又称天然凝胶电泳，可以保持蛋白质的天然形状和电荷。与变性凝胶电泳最大的区别是，蛋白质在电泳过程中和电泳后不会变性，所以亚基和高级结构会保留下来。

SDS-PAGE:你姑姑已经不是你姑姑了！

土语-PAGE:你舅舅还是你舅舅。

(2)蛋白质的序列

技术：质谱，蛋白质测序

做一个小型质谱测试——性价比高。

每种蛋白质的氨基酸序列不同，因此当蛋白质被打断时，产生的肽段也不同，肽混合物的质量数具有一定的特征。利用测得的肽质量查找蛋白质和核酸序列库，结合合适的计算机算法，可以鉴定多肽序列。但这种方法不能用于直接测序，必须依赖大量的数据库信息进行比对，比直接蛋白质测序更经济。

蛋白质直接测序——成本高。

自然界中，有些化学物质喜欢抢占人的爱情，霸占别人的老婆，有些喜欢N端的氨基酸残基，有些喜欢C端的氨基酸残基。利用这个原理，我们可以专门找到流氓，知道哪些老婆把他们抢走了，把完整的蛋白质序列拼接在一起。

(3)蛋白质的功能预测

蛋白质的很多特性可以直接从序列分析中获得，比如疏水性，可以用来预测序列是跨膜螺旋还是前导序列。但是，一般来说，我们根据序列预测蛋白质的功能的唯一方法是搜索数据库，比较该蛋白质是否与已知功能的蛋白质相似。

蛋白质家族和结构域数据库：www.expasy.org/prosite/

PROSITE涉及的序列模式包括酶的催化位点、配体结合位点、与金属离子结合的残基、具有二硫键的半胱氨酸、与小分子或其他蛋白质结合的区域等。

(4)细胞内的蛋白质在哪里工作？胞外蛋白呢？

技术：免疫组织化学(IHC)，免疫荧光，ELISA，ELISPOT。

1)免疫组织化学(IHC):使用标记的特异性抗体来定位抗原在组织中的分布。相信有同学吐槽过，看到IHC两个字就吃不下了。

2)免疫荧光：用荧光物质标记抗体以定位细胞内抗原的技术。

两者的区别：IHC组织；IF单元格

3)伊莉莎、ELISPOT

1.ELISA:相信大家基本都做到了。想知道体液中一种蛋白质的浓度，首选ELISA，但是无法定位是哪个细胞分泌的胞外蛋白。

2.ELISPOT:基于ELISA的免疫原理，一组细胞在体外培养于细胞板孔中。预先固定在板孔中的抗体可以捕获细胞在生长过程中分泌的目标蛋白。显色后可以看出哪些细胞分泌了目的蛋白，即定位，或半定量测定其浓度。

ELISA和ELISPOT技术

(E)蛋白质-蛋白质相互作用

技术：GST下拉技术，Co-IP酵母双杂交技术

1)GST下拉技术：说白了就是钓鱼执法。

探针蛋白与GST(谷胱甘肽转移酶)融合，融合蛋白通过GST与固定在载体上的GTH(谷胱甘肽)亲和结合。因此，当与融合蛋白相互作用的蛋白通过层析柱或与固相复合物混合时，可以被吸附和分离。

2)Co-IP:免疫共沉淀

假设一个已知的蛋白质是一个大的蛋白质复合物的组成成员，利用这个蛋白质的特异性抗体就可以从溶液中“下拉”出整个蛋白质复合物，然后就可以用它来鉴定这个蛋白质复合物的其他未知成员，比如WB法。

喜欢一个B，B喜欢C，最后ABC做了一个快乐的Co-IP实验。

3)酵母双杂交技术：搭建鹊桥，牛郎织女相会。

酵母双杂交系统是基于真核基因的转录机制。真核转录因子GAL4包含两个不同的结构域：DNA结合结构域和转录激活结构域。但是他们两个是分开的，后一个基因无法开始表达。GAL4 DNA-BD可以识别DNA上的特定序列，并将GAL4 AD定位在起始基因的上游。GAL4 AD可以与转录复合物的其他成分相互作用。

一只聪明的研究狗在GAL4 DNA-BD上安装了一把钥匙，在GAL4 AD上安装了一把锁，如上图所示。只有当它们的钥匙和锁匹配时，GAL4 DNA-BD和GAL4 AD才能在相互靠近时发挥作用，才能正常翻译目的蛋白。

成千上万把锁和钥匙一把一把试。只有合适的锁和钥匙，才能让牛郎织女在鹊桥相会。

(6)蛋白质磷酸化检测——汽车钥匙

技术包括激酶活性分析和磷酸化抗体的蛋白质印迹。

蛋白质磷酸化是调控蛋白质活性和功能的最基本、最普遍、最重要的机制。

蛋白质的磷酸化主要发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸三种氨基酸上，因为其结构末端含有羟基，非常活泼，能与磷酸基团结合。磷酸化就像汽车钥匙。磷酸化是一路跑，去磷酸化是靠边(当然有些磷酸化是抑制作用)。

WB大家都做过，可以半定量，判断蛋白质的分子量。

蛋白质-核酸相互作用

技术：EMSA，芯片，芯片芯片，芯片序列，RIP序列

蛋白质与核酸相互作用，无论是DNA还是RNA。

那么蛋白质能和DNA做什么呢？原因只有一个：蛋白质与DNA序列结合调节基因表达，这是表观遗传学的范畴。

真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。染色质免疫沉淀分析(CHIP)是研究DNA与蛋白质相互作用最常用和最有效的方法。如下图，用已知目的蛋白的抗体富集蛋白-DNA复合体，拿去测序！